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Come rendere i coralli più colorati - seconda parte by Dana Riddle

Nuove informazioni sui Pigmenti verde Fluorescenti,Gruppi di Pigmenti, e fotoconversione dal Verde al Rosso/Arancio, di Dana Riddle
In questo numero, daremo un’occhiata alla categoria di pigmenti corallini più numerosa: Le Proteine Verdi Fluorescenti (o GFP). Inoltre, esamineremo come l’intensità luminosa e la qualità dello spettro influiscono sulle GFP.


Sommario

1. Glossario

2. Tipi di Pigmenti

3. Effetti dell’intensità luminosa e qualità dello spettro sulle GFP

4. Fotoconversione

5. Discussioni

Nella prima parte di questo articolo, abbiamo esaminato alcuni termini tecnici utili per comprendere la colorazione dei coralli. Abbiamo imparato che esistono diverse categorie di pigmenti colorati fluorescenti, e che questi pigmenti possono essere suddivisi in classi (o gruppi) in cui le origini ancestrali sono molto importanti nelle metodologie di classificazione.
In questo numero, daremo un’occhiata alla categoria di pigmenti corallini più numerosa: Le Proteine Verdi Fluorescenti (o GFP). Inoltre, esamineremo come l’intensità luminosa e la qualità dello spettro influiscono sulle GFP. E’ molto importante sottolineare che alcune GFP possono cambiare colore sotto l’effetto della luce (assumendo una fluorescenza rosso/arancio. Approfondiremo la fotoconversione in questo articolo.


I più comuni pigmenti fluorescenti sono I Verdi. Notare la granularità dei cromofori verde fluorescenti all’interno del tessuto corallino. Foto dell’autore.

Per rendere le cose più semplici a coloro che non hanno familiarizzato con la terminologia utilizzata, riporto nuovamente il glossario:


Glossario

  • Assorbenza: Capacità di un liquido o della superficie di una sostanza di trattenere la luce senza fenomeni di riflessione o trasmissione. 
  • Assorbimento: Processo con cui la radiazione incidente è trattenuta senza riflessione o trasmissione. 
  • Luminosità: Intensità di una emissione fluorescente
  • Gruppo: Per i nostri scopi in questo articolo, un clade è un gruppo tassonomico costituito da un singolo antenato comune e tutti i discendenti hanno in comune quell’antenato. I pigmenti dei coralli sono inclusi nei gruppo A, B, C, and D. Possono essere definite Gruppi anche essere viventi ben definiti (gruppi of Symbiodinium - zooxanthellae – sono un ottimo esempio.)
  • Cromofori: La porzione colorata di una molecola di pigmento. In alcuni casi, per cromofori si intende un involucro granulare contenente numerose molecole di pigmento.
  • Pigmento Cromoproteina: Pigmento non fluorescente ma molto colorato. Questi pigmenti appaiono colorati in quanto riflettono la luce. Ad esempio, una cromoproteina con un assorbimento massimo di 580nm può apparire viola perché prevalentemente riflette le onde con spettro blu e rosso.
  • Pigmenti Cromo-Rossi: Un tipo di pigmento studiato di recente che possiede caratteristiche sia delle cromoproteine, sia delle proteine fluorescenti DS-red. Il picco di fluorescenza è a 609nm (super rosso).


  • Proteine azzurro-fluorescenti (CFP): Pigmenti blu-verdi con emissione di fluorescenza nell’intervallo di circa 477-500nm. I pigmenti blu-verdi hanno in comune una quasi identica struttura dei cromofori. I pigmenti blu-verdi si manifestano a livelli di luce inferiori rispetto ai pigmenti verdi, rossi o nonfluorescenti.
  • Emissione: La luce che è emessa da un pigmento fluorescente.
  • Coefficiente di estinzione: La quantità di luce assorbita da una proteina sotto l’influenza di un determinato insieme di fattori.
  • Eccitazione: La luce assorbita da un pigmento fluorescente. Una parte della luce di eccitazione è fluorescente, o emessa ad un minor livello di lunghezza d’onda energetica (colore).
  • Pigmento DS-Red: Un tipo di pigmento rosso fluorescente con una singola emissione di banda primaria a 574-620nm. Originariamente riscontrato nei coralli Discosoma.
  • Fluorescenza: Assorbimento di radiazione ad una specifica lunghezza d’onda (o colore) and emissione ad un’altra lunghezza d’onda (colore). L’assorbimento è anche chiamato eccitazione. La fluorescenza finisce molto presto, dopo che è stata rimossa l’origine dell’eccitazione. (nell’ordine di circa 2-3 nanosecondi: Salih and Cox, 2006).
  • Proteina verde fluorescente (GFP): Pigmento fluorescente con emissione di 500-525nm.
  • Hula Twist: Una flessione delle molecole dei pigmenti dovuta ad un cambio di colore. I legami molecolari non sono rotti; per cui il pigmento può muoversi avanti e indietro, con movimenti che ricordano un ballerina hula.
  • Pigmento di tipo Kaede: Un tipo di pigmento rosso fluorescente con una caratteristica emissione primaria a circa 574-580nm e un emissione secondaria a circa 630nm. Riscontrati originariamente nei coralli Trachyphyllia geoffroyi, ma è molto comune anche nei coralli del sottordine Faviina.
  • Proteine infiammanti: Una proteina capace di essere convertita da non fluorescente a fluorescente. Spesso chiamate 'Kindling Fluorescent Protein', or KFP.
  • Carico quantico: Quantità di energia assorbita utilizzata per il processo di fluorescenza. Se l’assorbimento è uguale a 100 fotoni,e la fluorescenza è di 50,allora il carico quantico è 0.50.
  • Fotoschiarimento: Alcuni pigmenti, come i Dronpa, perdono fluorescenza se vengono esposti ad una luce molto forte (in questo caso,inizialmente appaiono verdi,e schiariscono fino a diventare non fluorescenti quando sono esposti ad una luce azzurra). Il foto schiarimento può ovviamente causare drastici cambiamenti nella fluorescenza. Nei casi in cui sono coinvolti più pigmenti, la perdita di fluorescenza (o trasferimento di energia da un pigmento donatore ad uno ricettore) può causare dei drastici cambiamenti nella colorazione.
  • Fotoconversione: Un riordinamento della struttura chimica di una proteina colorata causato dalla luce. A seconda delle proteine, la fotoconversione può aumentare o diminuire la fluorescenza (Processi chiamati rispettivamente fotoattivazione e fotoschiarimento). La fotoconversione può rompere i legami molecolari delle proteine (come nei pigmenti fluorescent Kaede and Eos) con la conseguenza di un irreversibile cambiamento del colore, oppure le molecole possono essere 'agitate' dall’energia luminosa ('hula twist'), e in questo caso l’inversione della colorazione è possibile a seconda della qualità e della quantità di luce disponibile. (processo noto come fotomutazione).
  • Proteine Rosso Fluorescenti (RFP): Questi pigmenti hanno un emissione a circa 570nm e oltre. Tra essi vi sono i pigmenti Ds- Red, Kaede and Chromo-Red.
  • Stokes Shift: La differenza tra la massima lunghezza d’onda della luce di eccitazione di un pigmento fluorescente e la massima lunghezza d’onda della luce di emissione. Ad esempio, un pigmento con un eccitazione ad una lunghezza d’onda di 508nm e un’emissione ad una lunghezza d’onda di 535nm avrà uno Stokes Shift pari a 27nm.
  • Soglia o Soglia di Colorazione: Il punto in cui la produzione di pigmenti è sufficiente per generare la fluorescenza (o assorbimento nel caso di cromoproteine non fluorescenti) distinguibile visivamente. Il termine “soglia” si riferisce generalmente alla produzione di pigmenti, anche se, in alcuni casi, può essere indicare un livello di luce in cui i pigmento scompaiono (come nel caso del foto schiarimento o della foto conversione).
  • Proteina Giallo Fluorescente: Un raro gruppo di proteine fluorescenti con emissione nell’intervallo tra 525-570 nm (Alieva et al., 2008).


Tipi di Pigmenti


Esistono almeno nove tipi conosciuti di pigmenti di coralli. Nota: I tipi di pigmenti,ad esempio il verde o il rosso potrebbero non essere strutturalmente simili ad altri pigmenti verdi o rossi su un tessuto differente – vedi sotto). Essi includono:
  • Proteine Fluorescenti Blu-Verdi (CFP) – Questi pigmenti sono di colore azzurro con un emissione massima fino a ~500 nm. La struttura dei cromofori è molto simile a quella dei pigmenti verde fluorescenti.
  • Proteine Verde Fluorescenti (GFP) – Questo gruppo, di sicuro, è il gruupo più numeroso di protein fluorescenti. La struttura dei cromofori verde fluorescenti è molto simile a quella dei cromofori blu-verdi.
  • Proteine Giallo Fluorescenti (YFP) – Un insolito gruppo di proteine fluorescenti con un emissione massima nella porzione gialla dello spettro luminoso. Molto raro nella sua distribuzione biologica, YFP è stato riscontrato negli zoantidi e in alcune specie di coralli duri (Agaricia).Personalmente, Ho notato la fluorescenza gialla in pochissimi coralli duri (specialmente Porites) qui nelle Hawaii, durante un immersione notturna utilizzando un’attrezzatura specifica per rilevare questa colorazione (vedi www.nightsea.com per i dettagli su questa attrezzatura).
  • Proteine Arancio Fluorescenti (OFP) – Ho individuate questo ‘tipo’ di proteine nel tentativo di evitare confusione. OFP è usato per descrivere un pigmento riscontrato nel corallo duro Lobophyllia hemprichii e il suon nome ci indica che è un particolare tipo di proteina con caratteristiche univoche. Infatti, OFP è semplicemente una variante della proteina fluorescente Kaede-type.
  • Proteine Rosso Fluorescenti (RFP) – Un gruppo di proteine che include numerosi sottotipi: (Kaede, Ds-Red and Chromo-Red). Generalmente, l’emissione fluorescente si ha nell’intervallo tra circa 580 nm fino ad oltre 600 nm.
  • Dronpa – Un pigmento verde fluorescente che perde la fluorescenza se viene esposto ad una luce azzurra di circa 490 nm, ma essa ritorna con un irradiazione di luce viola a 400 nm.
  • Proteine infiammanti – Una proteina (riscontrabile nell’anemone Anemonia sculata) i cui pigmenti cambiano da non-fluorescenti a fluorescenti. Questo cambiamento è reversibile e questo stato dipende dalla qualità della luce che attraversa i pigmenti.
  • Proteine Rosso Cromo - Una nuova classificazione (Alieva et al., 2008) di un singolo pigmento fluorescente riscontrato nel corallo Echinophyllia. Questo pigmento rosso-cromo ha la caratteristica di una cromoproteina non-fluorescente, ma ha una fluorescenza riscontrabile a circa 609 nm.
  • Cromoproteine (CP) – Questo è un gruppo di pigmenti non fluorescente,o con fluorescenza minima (dove il carico quantico è prossimo allo zero). Al posto di basare la colorazione sulla fluorescenza,questi pigmenti assorbono maggiormente la luce in una ristretta porzione dello spettro visibile. La maggior parte delle cromoproteine dei coralli assorbono maggiormente la luce a 560-593 nm. Ci sono casi di anemone che assorbono la luce ad una lunghezza d’onda di Massimo nell’intervallo di 480-500nm. Alcune cromoproteine sono molto simili nella struttura alle proteine fluorescenti Ds-Red. Infatti, ingegneri genetici hanno dimostrato che la sostituzione di un singole aminoacido nella proteina può fare la differenza fra fluorescenza e non-fluorescenza. Le cromoproteine non hanno suscitato molto interesse nei ricercatori, e ci sono solo 40 tipi di esse ad oggi descritte
Tabella 1. Una lista parziale di Pigmenti Verde Fluorescenti (GFPs) e loro caratteristiche.


Effetti dell’intensità luminosa e della qualità dello spettro sulle GFP


Le informazioni seguenti derivano maggiormente dal lavoro di D’angelo e collaboratori (2008). Esse offrono interessanti dettagli su alcuni fattori necessari a favorire la produzione di pigmenti fluorescenti nei coralli. La prima persona che ha approfondito gli esperimenti di D'Angelo è stato il dott. Joerg Wiedenmann, il quale è stato così gentile da fornirci informazioni dettagliate sui suoi esperimenti con la luce. Gli esperimenti con luce alta/bassa sono stati condotti utilizzando una lampada HQI da 400-watt Aqua Medic Aqualine 13,000K. Per gli esperimenti sui colori sono state utilizzate due lampade differenti; Con i filtri verde e rosso, è stata usata una HQI da 250W Osram Powerstar HQITS. Il filtro blu, invece, è stato usato insieme ad una HQI BLV 20,000K Nepturion da 250W. L’intensità di PAR è stata standardizzata a 200 µmol·m²·sec. Un ringraziamento al Dr. Wiedenmann per queste informazioni aggiuntive!

Pigmento fluorescente verde 512

  • Ospite: Acropora millepora
  • Gruppo di pigmenti: C2
  • Tipo di pigmento: Proteina verde Fluorescente
  • Maggior fluorescenza rilevata con: Luce blu (vedere commenti sotto riportati)
  • Intensità di luce richiesta: Fluorescenza maggiore rilevata a 700 µmol·m²·sec
  • Fotoconversione Possibile: Si (come osservato nelle caratteristiche spettrali su Acropora tenuis, e come riscontrato su altri pigmenti osservati in Acropora millepora).

Figura 1. Intensità luminosa e I suoi effetti sull’intensità di fluorescenza. La luce è stata prodotta da una lampada HQI da 13,000 K.(D'Angelo e co., 2008).


Figura 2. Effetti del colore della luce sul pigmento fluorescente verde 512 presente nell’ Acropora millepora. L’intensità luminosa è stata di 200 µmol·m²·sec in ciascun trattamento (D'Angelo e co., 2008).

La fotoconversione viene raramente menzionata nelle pubblicazioni scientifiche sui coralli contenenti il gruppo di pigmenti di tipo C. Basandosi sulle informazioni di Papina e co. (2002), possiamo concludere che la fotoconversione avviene nei pigmenti del gruppo C2 (riscontrati maggiormente nelle specie Acropora ). Mentre I dati di Papina indicano che la fotoconversione avviene nel pigmento 517 presente nell’ Acropora tenuis, abbiamo prove certe che essa avviene anche nell’Acropora millepora, in cui l’esposizione ai raggi UV-A aumenta del doppi la fluorescenza del Pigmento 513.



Figura 3. Un caso di possibile fotoconversione mostrato da Papina e co., 2002.

Pigmento Verde Fluorescente 514

  • Ospite: Montipora digitata
  • Gruppo di pigmenti: Sconosciuto, probabilmente C3
  • Tipo di Pigmento: Proteina verde Fluorescente
  • Maggior fluorescenza rilevata con: Luce blu
  • Intensità luminosa richiesta: Miglior fluorescenza rilevata a 400 µmol·m²·sec
  • Fotoconversione Possibile: Sconosciuta, ma improbabile.

Figura 4. Effetti dell’intensità luminosa generata da una lampada HQI da 13,000 K. 
( D'Angelo e co 2008).

Figura5. Effetti del colore della luce sulla generazione di pigmenti Verdi fluorescenti in un corallo comune in acquario: Montipora digitata.

Fotoconversione


La Fotoconversione – riordinamento dei cromofori indotto dall’energia luminosa che ha come risultato un cambiamento nella colorazione percepita – si sa che avviene in un gran numero di pigmenti verde fluorescenti.

Fotoconversione delle GFPs a Pigmenti Tipo Kaede


La natura talvolta ama confonderci, e la conversione (causata dall’energia luminosa) di un pigmento in un altro con differente fluorescenza è un ottimo esempio. La fotoconversione può avvenire in molti pigmenti, ma è maggiormente documentata in quei pigmenti classificati come pigmenti Kaede. Questi pigmenti sono stati individuati maggiormente nel sottordine Faviina (che include circa 60 generi di coralli duri, incluso Catalaphyllia, Favia, Lobophyllia, Montastraea, Mycedium, Trachyphyllia e altri), ma è stata riscontrata anche in alcuni coralli molli (Dendronephthya sp.), e corallimorfari (Ricordea). La fotoconversione da verde ad arancio/rosso nei pigmenti Kaede richiede luce blu (vedi tabella 2).

Tabella 2. Fotoconversione: Le proteine Verdi Fluorescenti convertono a Pigmenti Kaede arancioni (Clade D) sotto esposizione a luce ultravioletta/viola/blu.



Tabella 3. Un caso di sbiancamento indotto dalla luce nei pigmenti del gruppo D.




Caratteristiche spettrali dei Pigmenti Kaede prima e dopo la Fotoconversione

Le figure dalla 6 alla 9 dimostrano le caratteristiche spettrali dei pigmenti Kaede prima e dopo la fotoconversione indotta dalla luce violetta.



Figura 6. Favia favus contiene una GFP può essere convertita in un pigmento Kaede arancio.

Questa conversione è probabilmente indotta da una ‘forte’ luce blu o viola.



Figura 7. Un pigmento verde mostra piccoli segnali di fotoconversione ma…


Figura 8. …l’esatto contrario è molto evidente in questa particolare specie di Montastraea.


Figura 9. Un caso di fotoconversione in corso nella Ricordea florida. E’un pigmento Kaede e la fotoconversione è probabilmente indotta da luce viola/blu. (Labas e co., 2002).

Fotoconversione di Pigmenti simili ai GFP a Pigmenti DS-Red


Questo tipo di pigmento è stato originariamente isolato dai corallimorfari Discosoma, ma i pigmenti di tipo Ds-Red type sono stati trovati negli anemoni, corallimorfari, zoantidi e coralli duri.

E’ noto che la fotoconversione avviene in alcunu pigmenti Ds-Red, ed ‘è stata ben studiata nelle specie Discosoma. Cosa molto interessante, il cambiamento di fluorescenza da verde (emission at 500 nm) a rosso (emission at 583 nm) non richiede energia luminosa e può avvenire al buio – questo cambiamento è indotto da ossidazione chimica. Comunque, possono avvenire diverse conversioni da rosso a rosso acceso e da rosso acceso a blu quando alcune specie sono esposte a determinate radiazioni luminose.



Figura 10. Esperimenti di laboratorio hanno evidenziato il cambiamento dell’emissione fluorescente di questo pigmento da verde a giallo sostituendo solo 3 amino acidi nella proteina. Comunque questo fenomeno non è stato riscontrato in natura.

Tabella 4. In questo caso, la conversione cromatica è causata da processi chimici e può avvenire al buio.





Un potenziale caso di fotoconversione: Un cambiamento minore di Fluorescenza verde nell’Anemonia sculata?

La figura 11 è stata inserita per dimostrare un possibile caso di fotoconversione in una specie di anemone (Anemonia sculata). I doppi apici di eccitazione ed emissione suggeriscono che sta compiendo, o ha possibilmente compiuto, un cambio di fluorescenza di circa 20 nm (da 522 nm a ~550 nm).



Figura 11. Questo pigmento riscontrato nell’ Anemonia sculata appartiene al gruppo A. notare i doppi apici curve di eccitazione ed emissione. Questo indica una possibile fotoconversione.

Discussioni


In entrambi I casi esaminati, la luce blu induce la produzione di proteine fluorescenti, mentre la luce rosse è quella che ha meno effetto nella produzione di queste proteine. Comunque, bisogna notare che l’energia luminosa non è sempre il fattore decisivo nella produzione dei pigmenti. Ad esempio, la produzione e/o la conversione dei pigmenti sono dovute a reazioni chimiche e sono quindi indipendenti dagli effetti (o più propriamente non-effetti) delle radiazioni – notiamo questi fenomeni in almeno un caso che riguarda un anemone e i suoi pigmenti del gruppo A. Anche l’ossidazione chimica può avere un ruolo importante(ma non sempre) nella trasformazione cromatica notata in alcuni pigmenti di tipo DsRed. Comunque, nei casi in cui l’energia luminosa è necessaria, dobbiamo tener presente le categorie di intensità luminosa descritte da D’Angelo:
  • 'Molto bassa' (80 µmol·m²·sec)
  • 'Bassa' (100 µmol·m²·sec)
  • 'Moderata' (400 µmol·m²·sec)
  • 'intensa' (700 µmol·m²·sec)
  • fotoperiodo di 12 ore.
Le categorie ‘Molto bassa ’ e ‘Bassa’ sono facilmente raggiungibili in acquario utilizzando mezzi economici per la produzione di luce. La categoria 'Moderata' (400 µmol·m²·sec) è riscontrata meno frequentemente rispetto alle altre sopra citate. La produzione di questa quantità di energia luminosa è possibile utilizzando fonti di luce più potenti, come ad esempio le lampade HQI, lampade a LED e lampade fluorescenti multiple. La categoria ‘intensa’ (700 µmol·m²·sec), secondo le mie osservazioni è raramente riscontrata. Tuttavia, è possible ottenerla selezionando accuratamente le posizioni degli animali in vasca e utilizzando potenti sorgenti luminose. Bisogna tenere presente che in alcuni pigmenti è possibile il fotosbiancamento (ad esempio, nel pigmento 'Dronpa' - vedi Tabella 3). Le caratteristiche spettrali delle lampade sono importanti nella stimolazione della produzione di pigmenti colorati. In entrambi i casi esaminati in questi mesi, per i Pigmenti 512 (in Acropora millepora) e i Pigmenti 516 (in Montipora digitata), la luce blu si è rivelata di gran lunga la più efficiente nella stimolazione della produzione nei coralli di proteine verdi fluorescenti. Ma ci sono delle differenze – questi pigmenti di Acropora millepora (Gruppo C2) probabilmente non sono così sensibili ad altre lunghezze d’onda (incluso verde e rosso) così come i pigmenti della Montipora digitata (del Gruppo C3). Non è chiaro se questa differente risposta ad uno specifico colore di luce sono caratteristiche comuni ai rispettivi gruppi, e sarà interessante vedere i risultati delle prossime ricerche. Sappiamo molto poco su come rispondono alle stimolazioni i pigmenti del Gruppo C1 (individuati e descritti nelle specie Meandrites e Eusmilia ). Inoltre, ricordiamo che l’intensità luminosa per gli esperimenti con la ‘ luce colorata ’ è stata di 200 µmol·m²·sec. La fotoconversione dei pigmenti Verdi nel gruppo C2 è conosciuta. (I pigmenti del gruppo C2 sono quelli descritti più frequentemente, essendo presenti nelle specie Acropora e Stylocoeniella ). E’ noto che la radiazione ultravioletta causa un incremento di fluorescenza doppio nel Pigmento 513 (vedere i commenti sulle radiazioni UV nel prossimo paragrafo). I pigmenti arancioni Kaede si trovano maggiormente – e non esclusivamente – nei coralli del sottordine Faviina(ma si sa che sono presenti anche nei coralli molli (Dendronephthya) e nei corallimorfari (Ricordea florida). La conversione delle proteine verde fluorescenti a pigmenti arancione di tipo Kaede è stata osservata quando gli animali sono stati esposti a radiazioni UV-A, e lunghezze d’onda viola/blu. Bisogna fare attenzione nel dosaggio dei raggi UV-A nel tentativo di stimolare la colorazione. Molti “salva schizzi” plastici presenti sulle lampade sono trasparenti a parecchie lunghezze d’onda UV-A e quindi non è necessario incrementare deliberatamente la quantità di radiazione UV-A per indurre la produzione di pigmenti. Detto questo, ci sono alcune informazioni (basate su mie personali osservazioni) per cui il colore di alcuni pigmenti in alcune specie di coralli può aumentare quando la radiazione UV viene leggermente incrementata. Come ho detto prima, I primi risultati delle analisi sono state effettuate utilizzando utili informazioni sul tipo di lampade usate negli esperimenti di D’Angelo e co., ed ho quindi ordinato lampade e filtri appositi. Sono interessata maggiormente nell’osservazione delle caratteristiche della luce trasmessa, e riporterò I risultati non appena saranno disponibili. La prossima volta, daremo un’occhiata più da vicino alle proteine fluorescenti rosso e arancio, e come essi sono influenzati dall’intensità e dallo spettro luminoso.


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Ringrazio il forum Reefitalia (con il quale collaboro) ed in particolar modo l'amministratore Mauro Milanesi, per avermi autorizzato alla pubblicazione dell'articolo.

Daniele Russo