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Ciclo dell’azoto by Marco Colasanti aka Marcola62

Interessante ed ottimo articolo sul ciclo del'azoto, scritto dal  Prof. Marco Colasanti 


Buona lettura

Nuovi sviluppi e nuove prospettive
Finora abbiamo sempre considerato il ciclo dell’azoto come una serie di reazioni lineari che si chiudono in cerchio. Ma è davvero un ciclo? Importanti scoperte fatte in questi ultimi anni hanno drasticamente rivoluzionato questo concetto. In questo articolo, cercherò di riportare alcuni di questi studi con l’intento e la speranza di riuscire a rendere comprensibile un argomento così complesso.
Introduzione
Il ciclo dell’azoto riveste un’importanza elevata in un ambiente chiuso come quello di un acquario. È grazie alla sua presenza che ci è possibile mantenere in vita pesci e invertebrati in un piccolo spazio vitale ed è quindi fondamentale imparare a conoscerlo, soprattutto per il rispetto nei confronti delle forme di vita che alleviamo.
Fino a pochi anni fa si pensava che il ciclo dell’azoto nella sua complessità fosse comunque un processo lineare e completo. Tuttavia, recentissime scoperte scientifiche hanno profondamente rivoluzionato le nostre ormai consolidate conoscenze sul ciclo dell’azoto e sui micro-organismi che mediano tali processi. Infatti, il ciclo globale dell’azoto nell’ambiente, in particolare in quello marino, è stato integrato con almeno tre nuovi link che includono: (1) l’ossidazione dell’ammonio da parte di un particolare gruppo di micro-organismi, gli archeobatteri (AOA); (2) la riduzione anaerobica dei nitrati a ione ammonio (DNRA); (3) i processi dell’ossidazione anaerobica dell’ammonio (ANAMMOX).
Nella prima parte di questo articolo cercherò di ricapitolare le fasi essenziali e più conosciute del ciclo dell’azoto: le trasformazioni dei principali protagonisti (azoto atmosferico, ione ammonio, nitrito, nitrato) e il ruolo svolto dalle specie batteriche coinvolte in questi processi.
Nella seconda parte, verranno approfondite le nuove vie con particolare riferimento al ruolo dei batteri, soffermandoci sulle implicazioni che queste nuove scoperte hanno apportato nel ciclo globale dell’azoto.
Il ciclo dell’azoto
L’azoto (N) è un nutriente essenziale per tutti gli organismi e, come componente critico delle proteine, vitamine e DNA, è fondamentale alle strutture e ai processi biochimici che definiscono la vita.
L’azoto esiste in diversi stati di ossidazione e in più forme chimiche ed è rapidamente convertito da micro-organismi sia sulla terra che nel mare.
In ambiente marino, l’azoto è presente in 5 forme:
(1) azoto gassoso (N2), molecola stabile che richiede sistemi enzimatici specializzati (presenti in alcuni tipi di batteri) per la fissazione e successiva utilizzazione;
(2) ione ammonio (NH4+), la specie naturale più ridotta dell’azoto e la più biologicamente disponibile in ambiente privo di ossigeno;
(3) ione nitrato (NO3-), la forma più ossidata dell’azoto e maggiormente utilizzabile in ambiente aerobio;
(4) azoto organico particolato (PON), forma organica dell’azoto predominante nei sedimenti;
(5) azoto organico disciolto (DON), una ricca miscela di molecole con un ampio range di composizione.
Una complessa rete di reazioni lega queste forme dell’azoto in processi che complessivamente prendono il nome di ciclo dell’azoto (Figura 1).
La più grande riserva di azoto sulla terra è sotto forma di gas inerte N2 (NN), rappresentando il 78% dell’atmosfera. Una piccola parte di N2 atmosferico viene “fissato” da particolari batteri azoto-fissatori (fissazione) e trasformato nella sua forma più ridotta (ione ammonio o NH4+) che può essere facilmente utilizzabile dagli altri organismi. Nell’ambiente marino in presenza di particolari batteri, l’ammonio viene rapidamente ossidato a nitrato in condizioni aerobiche (nitrificazione). Il nitrato a sua volta viene nuovamente ridotto a N2 gas in condizioni anaerobiche (denitrificazione), completando il ciclo (Figura 1).

Fissazione dell’azoto e ammonificazione
Come abbiamo detto precedentemente, l’azoto atmosferico (N2) prima di essere incorporato nelle molecole biologiche deve essere ridotto a ione ammonio (NH4+), in una sequenza di reazioni che complessivamente prende il nome di fissazione biologica dell’azoto. Tali reazioni sono catalizzate da un particolare enzima, la nitrogenasi, presente in alcuni batteri azoto-fissatori appartenenti soprattutto al phylum dei Cyanobacteria. Una delle caratteristiche peculiari di questo enzima è che viene irreversibilmente inibito dall’ossigeno molecolare (O2); e poiché la fissazione è un processo che avviene in ambiente aerobico questo crea un apparente paradosso. In realtà, i cianobatteri sono in grado di negoziare l’attività della nitrogenasi, un enzima essenzialmente anaerobio, con l’inevitabile presenza dell’ossigeno (proveniente dai processi fotosintetici), attraverso meccanismi non ancora del tutto chiariti. In ambiente marino, i batteri azoto-fissatori (alcuni appartenenti anche ai generi Clostridium ed Azotobacter) possono trovarsi sia in forma libera che in simbiosi con altri organismi (per esempio spugne).
La fissazione biologica dell’azoto si può sinteticamente rappresentare con la seguente formula globale:
N2 + 8H+ + 6e- 2NH4+
Cioè per ogni molecola di azoto atmosferico si formano due ioni ammonio con il consumo di 6 elettroni e di 8 H+, evento quest’ultimo che tende ad innalzare il pH.
Ma qual è la fonte di azoto nell’acquario? Certamente la fissazione biologica dell’azoto è un processo estremamente importante negli oceani, ma nelle nostre vasche ha un ruolo limitato. La principale fonte di azoto deriva dall’alimentazione sia per i pesci che per gli invertebrati, in particolare sotto forma di proteine e di singoli aminoacidi in caso vengano somministrati direttamente in vasca. Anche vitamine e altre molecole, come ad esempio il DNA, contengono azoto ma la quantità è decisamente minore rispetto alle proteine. Nelle proteine, l’azoto fa parte dello “scheletro” e di alcune catene laterali dei singoli aminoacidi come il triptofano, l’asparagina, la glutamina, la lisina, l’arginina e l’istidina.
La degradazione ossidativa degli aminoacidi conduce al rilascio di azoto ammoniacale in vasca. In che modo? Da una parte, le proteine ingerite dai pesci o da altri organismi vengono degradate in singoli aminoacidi. A loro volta gli aminoacidi possono essere usati per costruire nuove proteine nell’organismo oppure venire ossidati per fornire energia. La degradazione degli aminoacidi da parte degli animali porta all’eliminazione di prodotti diversi. Ad esempio i pesci rilasciano l’azoto come ammonio, mentre una gran parte di organismi può rilasciarlo sotto forma di acido urico (uccelli, rettili) o urea (ad esempio l’uomo). D’altra parte, in presenza di un forte carico organico, proteine e amminoacidi presenti nei prodotti di rifiuto, nei sedimenti e nella sostanza organica in putrefazione, vengono decomposti in un processo detto ammonificazione, attuato da particolari batteri decompositori che, degradando l’azoto amminico, liberano l’ammonio in acqua.
È interessante notare infine che lo ione ammonio in acqua è in equilibrio con l’ammoniaca (NH3) secondo la seguente stechiometria:
NH3 + H2O NH4+ + OHLa
concentrazione delle due specie chimiche dipende prevalentemente dal pH. Ovvero, più alta è l’alcalinità maggiore sarà la quantità di ammoniaca;
viceversa più basso è il pH (più acido) maggiore sarà la quantità di ione ammonio (meno tossico dell’ammoniaca). Come si può vedere nella Figura 2, in un range medio di pH dell’acqua di mare la percentuale di NH4+ è preponderante (82-97%) rispetto all’NH3 (3-18%).
Nitrificazione
La visione convenzionale della nitrificazione avviene in presenza di ossigeno e prevede l’ossidazione dell’ammonio a nitrato secondo la seguente formula sintetica globale:
2NH4+ + 4O2 4H+ + 2H2O + 2NO3- 
In realtà, la nitrificazione (Figura 1) avviene in due passaggi distinti: 1) ossidazione dell’ammonio a nitrito (nitrosazione) e 2) ossidazione del nitrito a nitrato (nitrazione).
1) NITROSAZIONE: nel primo passaggio, lo ione ammonio viene ossidato a nitrito in 2 tappe:
     a) La prima tappa è dovuta ad un enzima, la monossigenasi, che forma l’idrossilammina, usando O2 come ossidante:
          2NH4+ + O2 2NH2OH + 2H+
     b) Nella seconda tappa, l’idrossilammina viene ossidata a nitrito dall’enzima idrossilamminadeidrogenasi:
          2NH2OH + 2O2 2H+ + 2H2O + 2NO2-
2) NITRAZIONE: l’ossidazione del nitrito a nitrato, che avviene ad opera dell’enzima nitrito ossidasi, completa il processo della nitrificazione:
          2NO2- + O2 2NO3-
Ma chi dirige la musica? Il lavoro metabolico della nitrificazione è affidato a 2 gruppi di batteri nitrificanti:
1) batteri che ossidano l’ammonio (ammonia-oxidizing bacteria o AOB) detti anche batteri nitrosi. Appartengono prevalentemente ai generi Nitrosococcus e Nitrosomonas;
2) batteri che ossidano il nitrito (nitrite-oxidizing bacteria o NOB) detti anche batteri nitrici. Ne fanno parte i generiNitrobacterNitrococcus, e Nitrospina.
I batteri nitrificanti sono in genere aerobi obbligati e chemoautotrofi obbligati poiché usano direttamente CO2 come sorgente di carbonio, mentre le sostanze organiche possono risultare anche tossiche.
Denitrificazione
La denitrificazione è uno dei processi chiave nel ciclo dell’azoto e prevede la riduzione dei nitrati ad azoto gassoso, passando per nitriti, ossido nitrico (monossido di azoto) e ossido nitroso (protossido di azoto).
La denitrificazione è principalmente eterotrofica facoltativa e avviene in condizioni anaerobiche. Un ampio range di batteri, detti appunto denitrificanti, sono in grado di effettuare l’intera sequenza di reazioni, possedendo un apparato enzimatico completo.
batteri denitrificanti sono in grado di operare la respirazione anaerobica dei nitrati, usando il nitrato al posto dell’ossigeno come accettore degli elettroni liberati durante il processo respiratorio. I batteri denitrificanti possiedono un’unica catena respiratoria che normalmente trasporta gli elettroni verso l’ossigeno. Collegati alla catena respiratoria, a livello di citocromi, possiedono enzimi speciali (Figura 3), come la nitratoriduttasi (NAR) e lanitritoriduttasi (NIR) che, in assenza di ossigeno, permettono agli elettroni di fluire verso il nitrato o il nitrito. Sono enzimi adattativi che si formano nella membrana cellulare solo in condizioni di anaerobiosi: infatti, a parte la NAR, la sintesi delle riduttasi viene repressa in presenza di ossigeno.
Sono denitrificanti alcune specie batteriche dei generi PseudomonasThiobacillusParacoccus e Naisseria.
Ora descriverò in dettaglio le 4 tappe del processo di denitrificazione (Figura 3). Tra parentesi dopo i nomi delle specie chimiche è riportato lo stato di ossidazione dell’azoto. A questo proposito vedere anche la Figura 4:
I) riduzione del nitrato (+5) a nitrito (+3). Questa reazione è catalizzata dalla nitrato riduttasi (NAR) che risiede nel lato citoplasmatico (interno) della membrana batterica. Il nitrato viene trasportato all’interno della cellula batterica da un trasportatore specializzato (AP in Figura 3) definito antiporto perché scambia lo ione nitrato in entrata con il nitrito prodotto nella reazione e che deve essere portato nello spazio periplasmatico (esterno) per la reazione successiva.
2NO3- + 4H+ + 4e- 2NO2- + 2H20
II) riduzione del nitrito (+3) a ossido nitrico (+2). Il nitrito ora nello spazio periplasmatico viene ridotto dalla nitrito riduttasi (NIR) rilasciando ossido nitrico (o più correttamente monossido di azoto). L’ossido nitrico è una molecola sorprendentemente importante, dai batteri fino all’uomo (ma questa è un’altra storia).
2NO2- + 4H+ + 2e- 2NO + 2H20
III) riduzione dell’ossido nitrico (+2) a ossido nitroso (+1). L’ossido nitrico viene ridotto dalla ossido nitrico riduttasi(NOR) a ossido nitroso (chiamato anche protossido di azoto o meglio ancora monossido di diazoto conosciuto anche come gas esilarante). Entrambi gli ossidi rappresentano un forte stimolo alla sintesi delle riduttasi in presenza di nitrati e in condizioni anaerobiche.
2NO + 2H+ + 2e- N2O + H20
IV) riduzione dell’ossido nitroso (+1) ad azoto gassoso (0). L’ultima reazione del processo di denitrificazione è la riduzione dell’ossido nitroso ad azoto molecolare in forma gassosa da parte dell’ossido nitroso riduttasi. Questa reazione dovrebbe completare il processo di denitrificazione e chiudere il ciclo dell’azoto
N2O + 2H+ + 2e- N2 + H20
In conclusione, la reazione globale della denitrificazione (senza tener conto della degradazione delle molecole organiche eventualmente associata) può essere sintetizzata con la seguente formula:
2NO3- + 12H+ + 10 e- N2 + 6H20
Nuovi sviluppi e nuove prospettive
Quanto descritto precedentemente rappresenta uno scenario ben conosciuto ormai da diverso tempo. Nel corso degli ultimi anni però, i nostri riferimenti riguardo il ciclo dell’azoto sono drasticamente cambiati al punto che viene messo in discussione anche il principio lineare di ciclo chiuso. Questo perché sono state scoperte delle nuove reazioni e di conseguenza nuovi microrganismi che rendono tutto il ciclo dell’azoto molto più complesso e contorto (Figura 4). In questa seconda parte dell’articolo, cercherò di chiarire alcune vie importanti che si vanno ad inserire nel canonico ciclo dell’azoto:
(1) l’ossidazione dell’ammonio da parte di un particolare gruppo di microorganismi, gli archeobatteri (AOA);
(2) la riduzione anaerobica dei nitrati a ione ammonio (DNRA);
(3) i processi dell’ossidazione anaerobica dell’ammonio (ANAMMOX).
AOA: archeobatteri che ossidano l’ammonio
Recentemente, sono stati identificati nuovi protagonisti nel ciclo dell’azoto che fanno parte del più abbondante e diffuso gruppo di micro-organismi sul pianeta, gli archeobatteri. Nonostante non sia ancora sicura la linea evolutiva del gruppo, gli archeobatteri (Archaea o Archaebacteria) sono, insieme agli eucarioti e agli eubatteri, uno dei fondamentali domini degli esseri viventi (Figura 5).
Gli archeobatteri, come i batteri, sono costituiti da singole cellule mancanti di nucleo e assieme ai batteri sono stati in passato classificati come procarioti. In base all’analisi del DNA, gli archeobatteri sono raggruppati in tre phylum:CrenarchaeotaEuryarchaeota e Korarchaeota. Gli Euryarcheota sono i meglio conosciuti ed includono i metanoproduttori e gli alofili. I Crenarcheota comprendono microrganismi termofili, mentre i Korarchaeota sono ancora poco noti, poiché di loro si conosce soltanto il DNA, ma nessun microrganismo è stato finora isolato. Originariamente, si pensava che gli archeobatteri fossero solo gli abitatori degli ambienti più estremi ed inospitali della Terra. I termofili possono svilupparsi a temperature ben superiori ai 100 °C, gli psicrofili a quelle inferiori a -10 °C, mentre gli acidofili e gli alcalofili crescono rispettivamente in ambienti estremamente acidi o alcalini, infine gli alofili prediligono ambienti ad elevatissima salinità. Oggi sappiamo che gli archeobatteri sono presenti in tutti gli habitat: ad esempio i Crenarcheota sono stati inseriti come componenti ubiquitari dello zooplancton.
Nel 2004, fu scoperto in un Crenarcheota marino un particolare gene, l’ammonio mono-ossigenasi (amoA), suggerendo la capacità di ossidare l’ammonio. Il definitivo e convincente collegamento tra questo nuovo gene e l’ossidazione dell’ammonio negli archeobatteri è stato recentemente stabilito in un Crenarcheota, il Nitrosopumilusmaritimus, isolato dall’acqua di un acquario. N. maritimus è chemoautotrofico: infatti cresce con bicarbonato come unica fonte di carbonio (il carbonio organico ne inibisce la crescita) e converte l’NH4+ in NO2- (linea verde in Figura 4e Figura 7). Successivamente sono stati identificati altri archeobatteri con queste proprietà e gli è stato dato il nome di archeobatteri ossidanti l’ammonio (AOA o ammonia-oxidizing archaea). Un analisi accurata del gene amoA in molti archeobatteri ha rivelato diverse isoforme di questo gene, ognuno associato a microorganismi presenti in habitat differenti (con poca sovrapposizione ad esempio tra sedimento e colonna d’acqua). Sono stati identificati anche archeobatteri simbionti, come ad esempio il Cenarchaeum symbiosum, un Crenarchaeota simbionte con una spugna. Sorprendentemente, è stato osservato che questo archeobatterio non è in grado di produrre idrossilammina come intermedio di reazione (vedi il passaggio della NITROSAZIONE nel paragrafo della nitrificazione), indicando che l’ossidazione dell’ammonio avviene con un meccanismo differente da quello conosciuto nella nitrificazione classica. Infine, dalle ultimissime stime risulta che la maggior parte dei Crenarchaeota sono AOA e che gli AOA sono numericamente i microrganismi maggiormente presenti negli oceani.
DNRA: riduzione anaerobica dei nitrati ad ammonio
Negli ultimi anni, la riduzione anaerobica dei nitrati/nitriti o DNRA (acronimo di Dissimilatory Nitrate/nitrite Reduction toAmmonium) ha riscosso un certo interesse come reazione rilevante sia negli ecosistemi terrestri che marini. La reazione è stata descritta in sedimenti anossici e in presenza di batteri di tipo Thioploca e Thiomargarita. Entrambi questi tipi di batteri sono in grado di concentrare nitrati all’interno delle proprie cellule per la successiva ossidazione dei composti contenenti zolfo in forma ridotta. In questo modo, sono in grado di ridurre nitrati ad ammonio passando per il nitrito come composto intermedio (linea azzurra in Figura 4 e Figura 7). Questa reazione sebbene ancora non del tutto chiarita sembrerebbe fornire nitrito e ammonio per le reazioni ANAMMOX (vedi paragrafo successivo) in sedimenti anossici.
ANAMMOX: ossidazione anaerobica dell’ammonio
Come abbiamo visto precedentemente descrivendo gli AOA e le tappe della nitrificazione, l’ossidazione dell’ammonio è un processo strettamente aerobico. In realtà, abbiamo anche visto che l’ammonio si può generare in ambiente ipossico e anossico (ad esempio nei sedimenti) attraverso il processo di remineralizzazione dell’azoto organico (ammonificazione) o di riduzione anaerobica dei nitriti (DNRA). Per moltissimi anni si è pensato che l’ammonio in condizioni anaerobiche fosse inerte, cioè non utilizzabile dalle forme viventi. Il problema però è che non erano mai stati identificati batteri in grado di metabolizzare l’ammonio in mancanza di ossigeno, soprattutto per le difficoltà tecniche nel coltivare in laboratorio ceppi batterici con queste caratteristiche. Nel 2008, molte di queste difficoltà sono state superate e alcuni laboratori hanno identificato, coltivato e caratterizzato alcuni tipi di batteriANAMMOX (acronimo di ANaerobic AMMonium Oxidation) in grado di ossidare l’ammonio ad azoto gassoso (N2) (linea rossa in Figura 4 e Figura 7) utilizzando come accettore di elettroni il nitrito invece che l’ossigeno.
Il primo batterio ad essere isolato in ambiente marino fa parte del genere Scalindua (Sc. sorokinii) anche se si sta indagando l’esistenza di altri generi come Brocadia e Kuenenia. La caratteristica comune di questi batteri, unica nel suo genere, è la presenza di un organello specializzato detto anammoxosoma circondato da un particolare lipide (grasso) che contiene l’idrazina ossido riduttasi, un esclusivo enzima in grado di combinare nitriti e ammonio in un unico step (Figura 6). Questi batteri usano un meccanismo piuttosto complesso che coinvolge l’idrazina come intermedio. Tuttavia, la seguente reazione, incompleta e stechiometricamente non precisa, può rendere l’idea del processo ANAMMOX:
NH4+ + NO2- ® N2 + 2H2O
Questa reazione è stata descritta per la prima volta in campioni di sedimento prelevati in particolari ecosistemi marini (per esempio nel Mar Nero). È stato osservato che in quelle condizioni sperimentali il processo ANAMMOX era responsabile del 30-50% della perdita di azoto inorganico dal mare (sotto forma di N2), affiancandosi in modo significativo alla classica denitrificazione. Ma pensandoci bene se noi associamo il sopracitato processo DNRA con ANAMMOX abbiamo una vera e propria denitrificazione anaerobica, chiaramente non canonica. Infatti il DNRA fornisce nitrito (come intermedio di reazione a partire dal nitrato) e ammonio (quest’ultimo ottenuto anche dall’ammonificazione dell’azoto organico), e l’ANAMMOX trasforma il tutto in azoto gassoso. Una denitrificazione bella e buona. Chiaramente con meccanismi e ceppi batterici differenti, ma una denitrificazione.
La domanda ora è. Ma in condizioni analoghe, l’ANAMMOX può avvenire in acquario? Ovviamente non siamo in grado di stabilirlo ma possiamo fare alcune considerazioni. Un DSB spinto ad esempio o anche il famoso secchiello di Calfo, potrebbero riprodurre le condizioni ottimali per questo processo. Di fatto bolle di azoto sono visibili nella profondità del sedimento. A questo proposito è stato osservato sperimentalmente (non in acquario) che più è alto lo strato di sedimento, più è spinta la condizione anossica (l’ossigeno inibisce la reazione) e maggiore è la velocità di reazione. Quindi l’alta efficienza di un DSB nel rimuovere nitrati potrebbe essere dovuta oltre che ad una denitrificazione anaerobica classica, anche a denitrificazioni non canoniche; ovviamente resta da definire l’eventuale presenza dei ceppi batterici idonei. In Figura 7 è schematizzato un ciclo dell’azoto integrato con le nuove reazioni e le zone in cui avvengono.
In conclusione, queste continue scoperte chiariscono molti punti oscuri del ciclo dell’azoto ma aprono nuovi orizzonti e paradigmi che rendono ancora più complessi e affascinanti questi processi. D’altra parte, con questo articolo spero di non aver confuso ulteriormente le ormai consolidate idee sul ciclo dell’azoto. Mi auguro altresì che nel tempo anche queste nuove scoperte possano essere applicate ed integrate al mondo acquariofilo, nonostante le scarse ricerche scientifiche in questo ambito. Tuttavia, anche se solo teoriche, queste conoscenze ci permettono di comprendere meglio ciò che può avvenire nelle nostre vasche ed alimentare la nostra passione di acquariofili.


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Ringrazio il forum Reefitalia (con il quale collaboro) ed in particolar modo l'amministratore Mauro Milanesi, per avermi autorizzato alla pubblicazione dell'articolo.

Daniele Russo